RNA干扰(RNA interference，RNAi)的概念于1998年被发现，是一种天然存在的针对外源核酸入侵和基因表达控制的防御机制。此后不久，小干扰RNA(siRNAs)被确定为哺乳动物细胞中RNAi的介质。而且，研究发现siRNA的递送对于诱导RNAi介导的基因敲低是必要和充分的，因为RNAi的其他组分由细胞提供。因此，基于siRNA直接应用的RNAi为创新疗法开辟了新的途径，以及尝试探索将siRNA作为治疗药物。

 

不同于其他药物作用的RNAi机制

RNAi机制已被进行广泛研究，核糖核酸内切酶Dicer将较长的双链RNA或短发夹RNA加工成成熟的siRNA。这种siRNA也可以作为化学合成分子直接递送到细胞，在RNA诱导的沉默复合体(RISC)中引入，该复合体由包括Argonaute-2(Ago-2)和Dicer在内的几种不同蛋白组成。通过去除其“正义”或“乘客”链激活siRNA后，剩余的“反义”或“引导”链指导RISC与靶信使RNA(mRNA)结合，RISC中的Ago-2介导裂解。与反义技术相反，RNAi依赖于一种催化机制，因为在靶mRNA剪切后，载siRNA的RISC能够解离并与另一种mRNA分子结合。其机制还应与微小rna(miRNA)区分开来，miRNA仅与部分互补结合而siRNA作用依赖于100%互补。因此，siRNA在mRNA水平上转录后而不是翻译后作用于蛋白质。

图1. 合成小干扰RNA(siRNA)介导敲低机制

 

挑战：开发最佳siRNA

最佳siRNA应具有以下特点：不激活先天性免疫系统，高效而特异地切割其靶点，无脱靶（即对非靶基因的影响）或其他毒性作用，在体循环和靶细胞内部半衰期长/降解慢。从治疗的角度来看，第一个重要方面是选择正确的靶点进行沉默，以治疗特定的疾病。

设计一种有效siRNA的第一个方案于2001年发表。其中，Elbashir等人建议使用长度为21个核苷酸的siRNAs，G/C含量约为50%。此后，广泛的研究使siRNA设计有了许多改进。

图2. 小干扰RNA(siRNA)设计中的重要特征和示意图

 

现在使用的siRNA长度为19～29个核苷酸。短siRNA可能倾向于更多的非特异性结合，但在19-25个核苷酸的范围内，siRNA在基因沉默中表现出相似的效率。首选使用短siRNA，因为较长的siRNA可激发炎性抗病毒免疫应答。然而，目前引入化学核苷酸修饰可以有效预防这种不必要的副作用。

尽管关于靶mRNA结构对siRNA效率的影响存在长期争议，但许多研究揭示了局部靶二级结构和靶位点可及性对RNAi效率的直接相关性。在这种情况下，mRNA的5′-非翻译区（和3′-非翻译区）以及靠近起始密码子的序列不推荐作为siRNA靶标，因为该区域调控蛋白的结合可能阻碍RISC结合，从而阻碍沉默效应。相反，建议在起始密码子下游约50-100个核苷酸的开放阅读框中选择区域。此外，更接近起始密码子的siRNA似乎比更下游的siRNA更有效。

 

siRNA的递送系统

RNA分子必须被认为是不稳定的，容易发生快速的酶和非酶降解。学未修饰的裸siRNAs在血流中的半衰期仅约为5 min，只有少数细胞类型如神经元或视网膜神经节细胞能够摄取裸siRNAs。因此，递送策略的开发一直是体内使用siRNAs的一个主要瓶颈。

到目前为止，siRNA药物的临床批准仅限于siRNA与GalNAc偶联物递送至肝细胞，基于与肝细胞表面高表达而在其他细胞上大量缺失的去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)和脂质纳米颗粒(LNPs)的高亲和力结合，特别是作为第二代LNPs的“稳定核酸脂质颗粒”。基于用于细胞生长抑制药物如阿霉素(Doxil®)、柔红霉素(DaunoXome®)或长春新碱(Marqibo®)等制剂的脂质体已获批准。Alnylam和Arbutus、DLin-DMA、DLin-MC3-DMA和L319提供了三种基于脂质的siRNA递送系统。通过基于组合化学的策略获得的数千种脂质的大量筛选，其他LNPs被鉴定为有效的。除Alnylam外，Arrowhead（TRiM；靶向RNAi分子）和Dicerna等其他公司也建立了基于GalNAc的偶联平台，或GalNAc类似物作为ASGPR配体。

 

表1. 常用siRNA药物递送系统

 

获批临床的siRNA药物

RNAi机制发现20年后，首批siRNA药物已获得临床使用批准，如下表：

 

未来：其他疾病中的siRNA

除了第一类siRNA治疗药物已经上市外，其他几个还在早期或晚期临床试验中。

 

 

代谢性疾病

Nedosiran(DCR-PHXC；Dicerna Therapeutics)是另一种开发用于治疗PH的药物。它特异性抑制肝脏中主要LDH亚型的表达。LDH敲除也可有效治疗其他高草酸盐尿亚型，即PH2和PH3，并且可能比lumasiran靶向GO更有效。作为GalNAc-siRNA偶联物，每月皮下注射一次。多次给药开放性PHYOX3试验的数据显示，PH1和PH2患者的长期尿草酸盐水平持续降低，达到正常或接近正常范围。

Cemdisiran是另一种肝脏靶向GalNAc-siRNA药物，导致补体5(C5)蛋白的敲低。目前正在开发其用于治疗危及生命的罕见补体介导疾病，包括阵发性夜间血红蛋白尿、免疫球蛋白A肾病、非典型溶血性尿毒症综合征和全身性重症肌无力。

血液学

A型和B型血友病是fitusiran(ALN-AT3)的适应症，fitusiran是一种靶向SERPINC1 mRNA的GalNAc-siRNA结合物。通过减少抗凝血酶生成和增加凝血酶生成，fitusiran可纠正凝血失衡并预防出血表型。在I期和II期试验中，fitusiran导致非常显著的剂量依赖性抗凝血酶减少。III期试验已经完成或仍在进行中。

感染性疾病

siRNA药物RG6346介导了肝肝细胞中乙型肝炎病毒生命周期所需的乙型肝炎表面抗原的选择性敲低。2020年11月公布的一项I期试验结果显示，每4个月给药一次可导致乙型肝炎表面抗原水平大幅持久降低，持续至末次给药后1年。RG6346单独或联合其他研究性药物/获批的长期乙型肝炎病毒治疗的II期研究于2021年3月启动(NCT04225715)。

肿瘤学

突变型KRAS是许多癌症中最突出的致癌驱动因素。靶向KRAS G12D突变体的siRNA已在可生物降解的聚合物基质中配制，用于持续局部释放（LODER；局部药物EluteR）。值得注意的是，目前正在局部晚期胰腺癌患者中进行的一项研究采用了该siRNA与基于吉西他滨或白蛋白结合型紫杉醇的既定化疗联合。

眼部疾病

几个siRNA药物开发已经研究了眼部疾病。包括青光眼、年龄相关性黄斑变性(AMD)、干眼症（干眼综合征）、糖尿病性黄斑水肿(DME)、各种遗传性视网膜疾病等。

 

结论

RNAi发现二十多年后，siRNA药物为许多疾病的创新疗法开辟了新的途径。尽管有几个重大的挑战和问题，包括siRNA递送和副作用，延缓了这类全新药理学化合物的临床转化，但几种siRNA药物已获得临床使用批准，还有几种siRNA处于后期临床研究阶段。针对任何靶基因的siRNA也强调了识别最佳靶标的必要性。

 

参考文献：

Friedrich, M., Aigner, A. Therapeutic siRNA: State-of-the-Art and Future Perspectives. BioDrugs 36, 549–571 (2022). https://doi.org/10.1007/s40259-022-00549-3